纳米技术因优良理化性质，已广泛应用于医学、电子、食品等多个领域，但大规模生产与使用增加了人类对纳米材料（NMs）的暴露风险，其对人体健康和环境的潜在不利影响催生了纳米毒理学这一学科。然而纳米材料具有异质性，且缺乏标准化评估技术，从而导致传统检测方法（如比色法、常规流式细胞术（FC））易受纳米材料特异性干扰，产生假阳性或假阴性结果；且常规流式细胞术需进行细胞标记，进一步增加了纳米材料与试剂、荧光物质相互作用的干扰风险。这些干扰具有颗粒、浓度和检测方法的特异性，需单独优化，使得纳米毒性检测难度大、耗时且成本高昂。因此，亟需开发无干扰的一线筛选方法，即在研发早期识别有毒纳米材料及对应的浓度、时间节点的筛选方法，进而为后续机制研究给予线索，从而节省人力和财力资源。
Ampha Z32非标记微流控阻抗流式细胞仪（IFC法）与现有检测手段的不同之处在于，它能够顺利获得宽频率范围对单个细胞的电学特性进行高通量测量。其可同时在多个频率下进行单个细胞大小、膜特性和细胞内特性的检测以深入分析细胞状态。无标记特性意味着细胞在检测前不会被化学试剂修饰或经过复杂处理。重要的是在纳米毒性测试中，这一特性还能显著降低纳米材料诱导干扰的可能性。
本研究从一线筛选方法的角度，结合纳米材料可能引发的干扰，评估了Ampha Z32非标记微流控阻抗流式细胞仪（IFC法）在体外纳米毒性测试中的适用性。此外，该项研究还以U937人淋巴瘤细胞为模型，将其暴露于8种OECD参考纳米材料（二氧化钛（TiO₂）NM-100和NM-101、二氧化硅（SiO₂）NM-200和NM-203、氧化锌（ZnO）NM-110和NM-111、银（Ag）NM-300K和NM-302），进而对IFC检测方法进行了优化和标准化，并将其可靠性与两种传统检测方法（台盼蓝染色排除法和传统流式细胞仪）进行了对比。
Ampha Z32（IFC法）在纳米材料毒性检测中的适用性
不同检测缓冲液下Ampha Z32（IFC法）对U937细胞的检测效果
不同检测频率下，失活细胞（绿色）与活性细胞（红色）的分离（IFC法）
利用Ampha Z32（IFC法）可实现活细胞、坏死细胞及小型校准微球的分离
顺利获得Ampha Z32（IFC法）检测的NM-300K（Ag，100μg/ mL）对U937细胞的急性毒性效应。活细胞（红色），暴露在NM-300K中10min（蓝色），暴露在NM-300K中30min（紫色）和坏死细胞（绿色）
研究结果表明，Ampha Z32非标记微流控阻抗流式细胞仪（IFC法）在所有测试中均未检测到纳米材料的相关信号，也就是说所测试的8种具有不同化学组成、大小、形状和表面涂层的金属和金属氧化物纳米材料，均未对Ampha Z32的检测结果产生干扰。此外，Ampha Z32还检测到了NM-300K（Ag，100μg/ mL）对U937细胞产生的急性毒性效应，可见Ampha Z32非标记微流控阻抗流式细胞仪（IFC法）具有无标记的特点，不易受纳米特异性干扰，是一种有效、环保且可靠的纳米材料诱导毒性检测工具。
Ampha Z32（IFC法）的可靠性
剂量反应曲线（TB&IFC）。灰色虚为阴性对照，即健康细胞的平均值“SE”（%）。与对照组（0μg/ml）相比，单次方差分析（n≥3）结果显示，毒性效应具有统计性意义（P ≤ 0.05、**P ≤ 0.01和**P≤ 0.001）
Ampha Z32（IFC法）与Countess（TB染色法）对8种纳米材料的剂量-反应曲线表明，两种检测方法的检测结相关性极高（R²值接近1），且Ampha Z32单次样本可分析10000-20000个细胞，远多于TB染色法（200-300个），因此能更精准反映纳米材料的毒性效应。此外，经参数优化后（6MHz、缓冲液（PBS: 0.28M蔗糖= 1:4）、0.02Vtrigger level(V)）后，Ampha Z32不仅可以清晰区分活细胞、坏死细胞及不同尺寸颗粒，还能检测细胞死亡早期阶段（凋亡），比TB染色法更灵敏。
传统流式细胞仪（FC，左）& Ampha Z32（IFC，右）测量结果对比。阴性对照（未暴露细胞，红色）、阳性对照（加热处理细胞，绿色）和TNF-α/CHX + NM-100处理组（蓝色）
尽管Ampha Z32（IFC法）与Countess（TB染色法）的检测结果一致，但Ampha Z32（IFC法）和传统流式细胞仪（BD LSR Fortessa）的检测结果却存在较大差异，这是由于传统流式细胞仪（FC）易受纳米材料特异性干扰。例如NM-100（TiO₂纳米颗粒）会与FC染色剂或读数系统相互作用，导致凋亡诱导剂（TNF-α/CHX）处理组的活细胞群体（Annexin-V⁻/7-AAD⁻）被高估，导致活力数据严重偏离真实值。同时纳米材料还会吸附染料、充当荧光猝灭剂/增强剂，或散射/吸收光线，直接干扰光学信号的准确性。而Ampha Z32（IFC法）基于细胞阻抗信号（电阻+电抗）分析细胞状态，无需荧光染料或化学标记。纳米材料不会与阻抗检测的电学信号产生相互作用，仅细胞自身状态（膜完整性、大小等）影响检测结果，无额外干扰源，该研究团队在近期的研究中已将其成功应用于骨再生支架用纳米金刚石（非金属纳米材料）的毒性评估中，可见Ampha Z32（IFC法）在体外纳米毒性评估中具有优势显著。
与许多传统检测方法相比，Ampha Z32（IFC法）不使用有毒或对环境有害的试剂，更具环保性，可轻松适配于评估更大颗粒、化学品和药物的效应，是一种可靠性，是稳定、可信的细胞活力评估工具，不仅可作为纳米毒性一线筛选的优选方法，尤其适用于作为活力检测的一线筛选工具。 Ampha Z32 已升级为 Ampha X30，其针对从微小细菌、藻类、酵母到大型哺乳动物细胞等各类样本，预设了最佳测试模板。设备内置程序化冲洗功能，每个样本检测后自动执行冲洗，既防止芯片与管路堵塞，更能避免样本残留引发的交叉污染，操作与维护更便捷。
原文：Ostermann, M., Sauter, A., Xue, Y. et al. Label-free impedance flow cytometry for nanotoxicity screening. Sci Rep 10, 142 (2020).